スペクトル方式フローサイトメトリーの紹介
スペクトルフローサイトメトリーは1979年に初めて提案され（Wade et al. 1979）、2004年の国際分析細胞学会でJ P Robinson（Robinson et al. 2004）により最初の機能的スペクトルフローサイトメーターが発表され、2007年にパデュー大学により特許が出されました（Robinson 2019）。レーザー励起蛍光色素からの発光を特定の検出器に分割する従来のフローサイトメトリーとは異なり、スペクトルフローサイトメトリーはプリズムを使用して、検出器の配列に渡ってすべての発光を検出します。これにより、複数のレーザーからのスペクトルプロファイルやシグネチャーをすべて取得することができます。その後、複雑な数学的モデルを用いて、蛍光体のプロファイルの混合を解除し、各蛍光体を分離・同定します。
従来のフローサイトメトリーに対するスペクトルの利点の一つは、全スペクトルにわたって明確なシグネチャーがあれば、類似したピーク発光を持つ蛍光色素を使用できることです。この例として、APCとAlexa Fluor 647が挙げられます。これらの蛍光色素は、従来のフローサイトメトリーでは一緒に使うことができませんが、Violet レーザーからの発光プロファイルが十分に異なるため、スペクトルフローサイトメトリーで分離することができます（Ferrer-Font et al.2020）。この技術により、マルチカラー免疫表現型パネルのサイズを40以上のマーカーに拡張することができます。
優れたマルチカラーパネルデザインの原則は、スペクトルフローサイトメトリーでも同じように求められます。抗原密度、蛍光物質の輝度、パネルの最適化など、実験の生物学に関するある程度の知識はやはり必要です。Ferrer-Fontら（Ferrer-Font et al. 2020）は最近、スペクトルフローサイトメトリーのパネルデザインに関する詳細な情報をCurrent Protocols in CytometryにPanel Design and Optimization for High-Dimensional Immunophenotyping Assays Using Spectral Flow Cytometryを発表しました。
スペクトルフローサイトメトリーにおけるStarBright色素の使用について
新しいStarBright Dyesは、フローサイトメトリー用に特別に開発された独自の蛍光性ナノ粒子です。正確な励起・発光特性を持ち、明るいのが特徴です。特殊なバッファーを必要とせず、一般的な染色用バッファーのすべてに使用でき、安定性が高く、ロット間のばらつきが少ないのが特徴です。これらの色素の性能を従来のフローサイトメトリーとスペクトルフローサイトメトリーで比較したところ、両者とも非常によく似た性能を示し、集団の分離や陽性と判定される割合も良好でした（図1）。スペクトル式フローサイトメーターを使用したマルチカラーパネルのデータの詳細は、AAIとCYTOで発表したポスターに掲載されています。
図1. 従来のフローサイトメトリーとスペクトルフローサイトメトリーの比較。赤血球溶解したヒト末梢血を10%ヒト血清でブロックし、PBS中1%BSAでCD3SBB700 (MCA463SBB700), CD4SBV515 (MCA1267SBV515), CD8SBV610 (MCA1226SBV610), CD19SBV670, CD25SBV440 (MCA2127SBV440) 及びCD127A647 (HCA145A647) に30分染色を行いました。B細胞、ヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、制御性T細胞はそれぞれ区別することができた。A：従来のフローサイトメトリーとB：スペクトルフローサイトメトリーでは、見られる集団、得られるパーセンテージにほとんど違いはなかった。
StarBright色素のスペクトルプロファイル
図2. StarBright Dyesのスペクトルプロファイル。4レーザー（16UV-16V-16B-10R）Aurora Spectral Analyzer（Cytek）で作成した、StarBright Dyesと結合した抗体のスペクトルプロファイルです。
スペクトルフローサイトメトリーにおけるStarBright色素の利点
スペクトルフローサイトメトリーの利点は、発光ピークの近い蛍光色素を一緒に使って多色パネルにできることである。従来のフローサイトメトリーでは30色程度が限界であったものが、40色以上のパネルを作成することができるようになりました。多くのStarBright色素は固有のスペクトルを持つため、最大発光ピークが類似する色素との新しい組み合わせが可能である。例えば、StarBright Blue 700 (SBB700) DyeとPerCP-Cy5.5、StarBright Violet (SBV) 400 DyeとBrilliant Violet (BV) 421およびPacific Blue、SBB475とSBB515およびBV510、SBB610とBV605、SBB710とBV711などが適合します (図 3).
図3. ヒト末梢血を染色するための新規色素の組み合わせの例。
A：CD20PerCP-Cy5. 5とCD45ROSBB700（MCA461SBB700）の組み合わせ、
B：CD4PV421、CD8Pacific Blue（MCA1226PB）、CD3SBB440（MCA463SBB440）
、
C：IgDBV510、CD8SBV475（MCA1226SBV475）、およびCD2SBV515（MCA1194SBV515）、
D：CD4BV605およびCD8SBV610（MCA1226SBV610）、
E：TCR gdBV711およびCD14SBV710（MCA1568SBV710）。
多くのStarBright色素は、最大発光が類似している蛍光色素と組み合わせて使用することができ、より大きなパネルを作成することができますが、類似性スコアが高いものが多く、過剰な拡散につながります。従って、パネル設計のベストプラクティスに常に従う必要があります。これらの色素を互いに排他的なマーカーに分離することで、スプレッディングの効果を否定することができます。以下の表は、StarBright色素とBrilliant Ultraviolet（BUV）、Brilliant Violet（BV）、Brilliant Blue（BB）色素との類似性スコアを示しています。
表1. StarBright Dyeの類似性スコア
StarBright UltraViolet Dye |
Comparison Dye |
Similarity Score |
|---|---|---|
|
BUV395 |
0.99 |
|
|
Dyl350 |
0.95 |
|
|
BUV496 |
0.96 |
|
|
BUV563 |
0.94 |
|
|
BUV615 |
0.91 |
|
|
BUV661 |
0.84 |
|
|
BUV737 |
0.94 |
|
|
BUV805 |
0.91 |
StarBright Violet Dye |
Comparison Dye |
Similarity Score |
|---|---|---|
|
BV421 |
0.8 |
|
|
BV480 |
0.99 |
|
|
BV510 |
0.89 |
|
|
BV570 |
0.87 |
|
|
BV605 |
0.92 |
|
|
BV650 |
0.9 |
|
|
BV711 |
0.96 |
|
|
BV785 |
0.98 |
StarBright Blue Dye |
Comparison Dye |
Similarity Score |
|---|---|---|
|
PerCP-Cy5.5/BB700 |
0.95/0.83 |
References
- Ferrer-Font et al. (Ferrer-Font et al. 2020). Panel Design and Optimization for High-Dimensional Immunophenotyping Assays Using Spectral Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry.
- Robinson JP et al. (2004). Collection hardware for high speed multispectral single particle analysis. Cytometry 59A, 12-12.
- Robinson JP (2019). Spectral flow cytometry — Quo vadimus? Cytometry Part A 95, 823-824.
- Wade CG et al. (1979). Spectra of cells in flow cytometry using a vidicon detector. Histochem Cytochem 27, 1049-52.